tn5轉(zhuǎn)座酶作用原理

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Tn5轉(zhuǎn)座酶(Tnp)序列全長(zhǎng)477個(gè)氨基酸，包含三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：N末端、催化結(jié)構(gòu)域和C末端。N末端包含70個(gè)氨基酸，用于DNA結(jié)合;催化結(jié)構(gòu)域位于中間，包含一個(gè)“核糖核酸酶H樣基序”和α/β/α折疊結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)座過程中的催化作用;C端則主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

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　　Tn5轉(zhuǎn)座酶的作用機(jī)制主要遵循“剪切-粘貼”模式，具體過程如下：

　　識(shí)別與結(jié)合：

　　Tn5轉(zhuǎn)座酶首先識(shí)別并結(jié)合Tn5轉(zhuǎn)座子兩端的特定序列，即OE序列(Outside end sequence)，該序列通常為19 bp長(zhǎng)。

　　兩個(gè)Tn5轉(zhuǎn)座酶分子識(shí)別并結(jié)合兩個(gè)OE序列后，通過C端的相互作用形成二聚體突觸復(fù)合物，該復(fù)合物具有切割DNA的能力。

　　切割與轉(zhuǎn)移：

　　在Mg^2+或其他金屬離子的介導(dǎo)下，Tn5轉(zhuǎn)座酶活化附近的水分子，對(duì)轉(zhuǎn)座子5’端的一條DNA鏈進(jìn)行水解，形成3’-OH親核基團(tuán)。

　　3’-OH親核基團(tuán)進(jìn)一步攻擊互補(bǔ)鏈，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，并在另一活化水分子的作用下形成平端。

　　轉(zhuǎn)座復(fù)合體隨后結(jié)合到受體DNA的大溝上，通過3’-OH親核基團(tuán)對(duì)受體DNA雙鏈進(jìn)行親核攻擊，完成鏈轉(zhuǎn)移過程。這一過程中，轉(zhuǎn)座子從供體DNA中完全切除，并插入到受體DNA的靶位點(diǎn)。

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　　Tn5轉(zhuǎn)座酶的應(yīng)用：

　　由于其轉(zhuǎn)座的隨機(jī)性好、穩(wěn)定性高、插入位點(diǎn)容易測(cè)序等特點(diǎn)，Tn5轉(zhuǎn)座酶在分子生物學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用，包括但不限于：

　　一步法快速DNA建庫(kù)：在NGS文庫(kù)構(gòu)建中，Tn5轉(zhuǎn)座酶可以在片段化DNA的同時(shí)將接頭序列加入到靶序列兩側(cè)，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程并降低樣本量需求。

　　單細(xì)胞測(cè)序：利用Tn5轉(zhuǎn)座酶對(duì)單細(xì)胞DNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，研究單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)和遺傳變異。

　　表觀遺傳學(xué)研究：如ATAC-seq和CUT&Tag技術(shù)中，Tn5轉(zhuǎn)座酶用于研究染色質(zhì)的開放程度和蛋白質(zhì)-DNA互作關(guān)系。

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