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一、分辨率的物理基礎：瑞利判據 光學顯微鏡的分辨率遵循瑞利判據（Rayleigh Criterion），其數學表達式為： d=n?sinθ0.61λ?
其中： - d：最小可分辨距離（分辨率）；
- λ：照明光波長（單位：納米，nm）；
- n：物鏡與樣品間介質的折射率（空氣為1，油浸物鏡為1.515）；
- θ：物鏡對樣品張角的半角（數值孔徑 NA=n?sinθ）。
關鍵結論：
分辨率與波長成正比，與數值孔徑成反比。縮短波長或增大數值孔徑可提高分辨率。 二、影響分辨率的核心因素- 數值孔徑（NA）
- 定義：數值孔徑是物鏡收集光線能力的量化指標，NA=n?sinθ。
- 優化方法：
- 使用高折射率介質（如香柏油，n=1.515）替代空氣，可顯著提升NA；
- 選擇大孔徑物鏡（如油鏡，NA可達1.4-1.5）。
- 極限：受物鏡光學設計和制造工藝限制，NA通常不超過1.5。
- 照明光波長（λ）
- 可見光范圍：400-700 nm，短波長（如藍光，450 nm）可提高分辨率。
- 特殊光源：
- 紫外光（<400 nm）可進一步提升分辨率，但需特殊光學材料和樣品兼容性；
- 熒光顯微鏡中，激發光波長通常短于發射光，可優化信號對比度。
- 像差校正
- 球差：光線通過球面透鏡時聚焦點不一致，導致圖像模糊。
- 色差：不同波長光線折射率不同，導致顏色分散。
- 解決方案：采用消色差或復消色差物鏡，通過特殊玻璃組合校正色差。
- 場曲：圖像邊緣與中心不在同一焦平面，導致邊緣模糊。
- 解決方案：使用平場物鏡（Plan Apochromat）校正場曲。
三、分辨率的極限與突破- 理論極限：阿貝衍射極限
- 根據阿貝理論，光學顯微鏡的分辨率極限約為光波長的一半（λ/2）。
- 對于可見光（550 nm），理論分辨率極限約為220 nm。
- 突破衍射極限的技術
- 超分辨顯微技術：
- 受激發射損耗顯微術（STED）：通過抑制熒光分子發光范圍，實現20-80 nm分辨率；
- 光激活定位顯微術（PALM/STORM）：通過單分子定位，達到10-20 nm分辨率；
- 結構光照明顯微術（SIM）：通過頻域調制，將分辨率提升至約100 nm。
- 近場光學顯微術：
- 利用探針與樣品表面的近場相互作用，突破衍射極限，實現納米級分辨率（如掃描近場光學顯微鏡，SNOM）。
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發表于 2025-7-1 08:25:09
