光學(xué)顯微鏡的分辨率

云樞智造

一、分辨率的物理基礎(chǔ)：瑞利判據(jù)

光學(xué)顯微鏡的分辨率遵循瑞利判據(jù)（Rayleigh Criterion），其數(shù)學(xué)表達式為：

d=n?sinθ0.61λ?

其中：

• d：最小可分辨距離（分辨率）；
• λ：照明光波長（單位：納米，nm）；
• n：物鏡與樣品間介質(zhì)的折射率（空氣為1，油浸物鏡為1.515）；
• θ：物鏡對樣品張角的半角（數(shù)值孔徑 NA=n?sinθ）。
  

關(guān)鍵結(jié)論：
分辨率與波長成正比，與數(shù)值孔徑成反比。縮短波長或增大數(shù)值孔徑可提高分辨率。

二、影響分辨率的核心因素

• 數(shù)值孔徑（NA）
  • 定義：數(shù)值孔徑是物鏡收集光線能力的量化指標(biāo)，NA=n?sinθ。
  • 優(yōu)化方法：
    • 使用高折射率介質(zhì)（如香柏油，n=1.515）替代空氣，可顯著提升NA；
    • 選擇大孔徑物鏡（如油鏡，NA可達1.4-1.5）。
      
  • 極限：受物鏡光學(xué)設(shè)計和制造工藝限制，NA通常不超過1.5。
    
• 照明光波長（λ）
  • 可見光范圍：400-700 nm，短波長（如藍光，450 nm）可提高分辨率。
  • 特殊光源：
    • 紫外光（<400 nm）可進一步提升分辨率，但需特殊光學(xué)材料和樣品兼容性；
    • 熒光顯微鏡中，激發(fā)光波長通常短于發(fā)射光，可優(yōu)化信號對比度。
      
    
    
• 像差校正
  • 球差：光線通過球面透鏡時聚焦點不一致，導(dǎo)致圖像模糊。
    • 解決方案：使用復(fù)合透鏡組或非球面透鏡校正球差。
      
  • 色差：不同波長光線折射率不同，導(dǎo)致顏色分散。
    • 解決方案：采用消色差或復(fù)消色差物鏡，通過特殊玻璃組合校正色差。
      
  • 場曲：圖像邊緣與中心不在同一焦平面，導(dǎo)致邊緣模糊。
    • 解決方案：使用平場物鏡（Plan Apochromat）校正場曲。
      
    
    
  
  

三、分辨率的極限與突破

• 理論極限：阿貝衍射極限
  • 根據(jù)阿貝理論，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限約為光波長的一半（λ/2）。
  • 對于可見光（550 nm），理論分辨率極限約為220 nm。
    
• 突破衍射極限的技術(shù)
  • 超分辨顯微技術(shù)：
    • 受激發(fā)射損耗顯微術(shù)（STED）：通過抑制熒光分子發(fā)光范圍，實現(xiàn)20-80 nm分辨率；
    • 光激活定位顯微術(shù)（PALM/STORM）：通過單分子定位，達到10-20 nm分辨率；
    • 結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)（SIM）：通過頻域調(diào)制，將分辨率提升至約100 nm。
      
  • 近場光學(xué)顯微術(shù)：
    • 利用探針與樣品表面的近場相互作用，突破衍射極限，實現(xiàn)納米級分辨率（如掃描近場光學(xué)顯微鏡，SNOM）。
      
    
    
  
  

yyu099

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